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miR-21对小鼠心肌重构相关基因调节作用的研究

浏览80次 时间:2015年12月08日 16:36

张 越* 易 青陈 晶孙一峰2 李秀秀1

1.沈阳医学院公共卫生学院职业医学教研室,辽宁沈阳110000

2.基础医学院,辽宁沈阳110001

摘要:目的本研究探讨了miR-21抑制剂对小鼠心衰模型心肌重构相关基因MMP2MMP7基因表达的影响,为心衰时心肌重构的发病机制和心衰的治疗方法提供新的思路和实验依据。方法本研究通过建立小鼠心衰模型,采用实时荧光定量PCR方法检测miR-21抑制剂对MMP2MMP7 mRNA表达的影响。结果实时荧光定量PCR显示,miR-21抑制剂下调小鼠心肌MMP2 mRNA的表达,对MMP7表达没有显著影响。结论miR-21 抑制剂调控参与心肌重构的重要基因。

关键词:心肌重构;基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶7

中图分类号:R341文献标识码:A文章编号:1671-5837(2015)25-0013-02

miR-21 antagomiR targets the important regulators of cardiac remodeling

Zhang Yue*, Yi Qing, Chen Jing, Sun Yi Feng2, Chen Jing, Yang Yu Di

1.School of public health, Shenyang 110001 China

2.School of Basic Science, ShenYang Medical College, Shenyang 110001 China

AbstractObjective This study investigated the effects of miR-21 antagomiR on the regulation of myocardial remodeling genes. Methods The miR-21 antagomiR or scramble control was injected into mouse heart failure model, real time PCR was used to detect the MMP2MMP9 and 18S mRNA expression. Results miR-21 antagomiR downregulated the MMP2 mRNA expression and had no significant effect on MMP7 expresssion. Conclusion miR-21 targets the important regulator of cardiac remodeling.

心肌重塑是许多心血管疾病进展的标志,以心肌细胞肥大和心肌纤维化为主要特征。心肌纤维化最终会导致心力衰竭。病理性心室重塑中细胞外基质的合成增加而降解减少,  结果使细胞外基质总量增加,  产生纤维化。核酸内切酶Dicer负责剪切miRNA形成约为22个核苷酸的长度成熟的miRNA双链,研究发现,幼鼠心肌的Dicer基因敲除会导致心室重构和心肌纤维化,这暗示了miRNA参与了心肌纤维化等病理改变[1]

1材料与方法

1.1 心衰模型构建

取健康10周龄C57小鼠(清洁级),称重后麻醉,将小鼠固定于操作台的恒温垫上,做气管插管,接小动物呼吸机控制呼吸。无菌操作,左侧胸部备皮后心尖搏动最强处做切口,逐层剪开分离肌肉至暴露肋骨,用镊子分离心包膜后暴露左心耳和左心室,双目显微镜下可见左冠状动脉自左心耳缘中部向下走行,用无损伤丝线于左心耳下缘2mm左冠状动脉走形处做结扎,将心脏归位,膨肺,逐层关胸。观察小鼠呼吸情况,待小鼠恢复自主呼吸后关闭呼吸机,脱机后保留插管观察,至苏醒后拔出气管插管。对照组为同期开胸假手术组,除不结扎冠状动脉外,余过程同心力衰竭组。8周后做超声心动图确定建模成功。心衰动物模型分为两组,一组小鼠左冠状动脉结扎术后六周尾静脉注射特异的miR-21 反义核苷酸连续7天,另一组心衰小鼠作为对照组注射非特异的阴性对照miRNA

1.2 RNA提取、反转录以及实时荧光定量PCR实验

按照操作说明用总RNA提取试剂盒提取左心室总RNA,反转录成cDNAcDNA加入通用Taqman mastermixABI设计优化的探针及引物,cDNA模板以及去离子水。反应物加到96孔板中,.96孔板放入离心机中离心去除挂壁液体。将反应混合液放入实时荧光定量PCR仪进行循环反应,我们采用绝对定量方法计算出18SMMP以及MMP2的表达量,并且采用保守的18s作为内参,将MMP2MMP7的表达归一化到内参18s的表达。数据处理统计分析实验数据以均数±标准差表示,应用SPSS 11.0 统计软件进行student ttest 检验。以<0.05为有差异,<0.01为有显著性差异。

2 结果

miR-21对小鼠心脏MMP2(基质金属蛋白酶2)以及小鼠心脏MMP7(基质金属蛋白酶7)表达的影响:

心衰小鼠模型尾静脉注射连续注射miR-21抑制剂或者阴性对照7天后,取小鼠左心室,提取总RNA,反转录成cDNA,实时荧光定量PCR结果见图1和图2MMP2 mRNA基因绝对定量结果显示miR-21抑制剂可以明显下调MMP2 mRNA的表达,但是对MMP7基因的表达没有影响。我们采用绝对定量方法计算出18SMMP2以及MMP7的表达量,并且采用保守的18s作为内参,将MMP2MMP7的表达归一化到内参18s的表达。

*

Fig 1 Real time analysis results of MMP2

mRNA expression. * vs miR-21antagomiR,

p<0.001

Fig 1 Real time analysis results of MMP7

mRNA expression. Controlvs miR-21antagomiR,

p>0.05论著

14 2015 25

 

3 讨论

近年来的研究发现miR-21在多种实验动物心衰模型以及心衰患者的心肌中表达上调。表明miR-21表达的特异性改变在心力衰竭病理过程中可能具有重要作用。

心肌纤维化最终会导致心肌重构以及心力衰竭的发生和发展。MMPs(基质金属蛋白酶,可使纤维胶原降解的蛋白水解酶)和TIMPs (组织金属蛋白酶抑制剂) 之间表达失衡状态在心室重构中起重要作用。目前的MMP抑制因子均有不同程度的副作用,因此鉴定新的MMPs抑制因子对缓解心肌纤维化具有重要的意义。MMP2在细胞外基质平衡中起重要作用,我们证明了miR-21抑制剂可以降低小鼠心脏梗死区域MMP2的表达,进而有可能抑制成纤维细胞迁移和心肌纤维化,这为开发治疗心力衰竭的新药打下了基础。研究表明miR-21抑制剂可以调控心肌的纤维化[2]。,但是其在心脏中已经验证的调控基因却寥寥无几。

据报道miR-21 在人心力衰竭患者的心肌中表达上调并且可以促进心肌纤维化的进程miR-21是心肌细胞发生房颤的重要的信号分子[3],而MMP7在心衰患者心肌细胞中的表达上调,我们在本研究中探索了miR-21抑制剂是否影响影响人心肌成纤维细胞中基质金属蛋白酶(MMP7)的表达,进而影响房颤的信号通路。miR-21抑制剂具有抗肿瘤以及抑制纤维化的作用,将来有望用于新药开发,所以我们有必要对其调控机制进行深入

参考文献

[1]da Costa Martins PA, Bourajjaj M, Gladka M, et al. Conditional dicer gene deletion in the postnatal myocardium provokes spontaneous cardiac remodeling. [J].Circulation,2008, 118: 1567-1576

[2]Cheng Y,Zhang P,Yang J,etal. Ischaemic preconditioning-regulated miR-21 protects heart against  ischaemic/reperfusion injury  via  anti-apoptosis through its target CDPD4 [J].Cardiovasc  Res,2010,87(3):431-439

[3]Sophie Cardin,Eduard Guasch, Xiaobin Luo, Patrice Naud, et al;  [J].Physiology.2012,5;(1027-1035)

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81070128);l辽宁省杰出青年学者成长计划(教育厅优秀人才项目No. L2011112);教育部留学启动基金(20121707);人力资源与社会保障部科技项目择优资助(2015);沈阳医学院优秀人才项目(20113067)。大学生科研立项课题(20141038

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed
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